Лаборатория функциональной биохимии нервной системы

Основные направления научной деятельности

Исследование функционально-биохимических механизмов пластичности мозга. Роль апоптотическогих механизмов в функционировании клеток нервной системы в норме и при патологии. Роль оксида азота и систем его синтеза в мозге в норме и при патологии. Исследование функционально-биохимических механизмов патологий ВНД и разработка патогенетически направленных путей их коррекции. 

Наиболее важные результаты научных исследований:

1. Нейрохимические механизмы эффектов нейротоксинов как основа функциональных нарушений

На модели нейродегенерации. вызванной системным введением каиновой кислоты, показано, что судорожная активность коррелирует с показателями окислительного стресса, процессом апоптоза и экспрессией фактора транскрипции АР-1 в гиппокампе крыс. На модели лимбической эпилепсии, вызванной системным введением каиновой кислоты и сопровождающейся нейродегенерацией, показана возможность модуляции патологических эффектов введением цинка. Соединение цинка снижает степень судорожной активности, гибель нейронов и интенсивность апоптоза. Феномен модуляции глутаматной токсичности цинком in vivo открывает новые возможности коррекции патологий, опосредованных этим механизмом. 

На модели нейродегенерации, вызванной введением холинотоксина AF64A, в первичные нейрональные культуры гиппокампа, коры и септума эмбрионов крыс показано, что в дозах 5-80 мкМ AF64A вызывает отложенную апоптотическую нейродегенерацию, максимально выраженную через 3 дня (подтверждено морфологическими исследованиями, данными по жизнеспособности клеток и "DNA laddering"). Активность NO-синтазы в клетках снижалась в зависимости от дозы и времени. 

2. Участие нитрергической системы и протеолитических апоптотических механизмов в нейродегенерации при ишемии

На модели ишемии, воспроизведенной на органотипических культурах гиппокампа и первичных культурах клеток-зерен мозжечка, показано, что изменения генерации нитрита при ишемии зависят от использованной культуры. Исследовали эффекты ишемии на накопление нитритов в культурах клеток-зерен мозжечка. Показано усиление накопления нитритов в результате 2-часовой ишемии в среднем в 3,6 раза с последующим снижением через 2 ч реоксигенации и восстановлением нормального уровня через 4 ч реоксигенации. Предполагается, что выявленные изменения накопления нитритов отражают изменения активности синтазы оксида азота в клетках-зернах мозжечка при ишемии и реоксигенации Исследовано влияние ишемии (кислородно-глюкозной депривации) и реоксигенации на морфологию культивируемых клеток-зерен мозжечка крыс и активность в этих клетках каспазы-3. Общая протеолитическая активность незначительно повышается сразу после ишемии, тогда как специфическая активность каспазы-3 возрастает к 4-му часу реоксигенации (в этот период морфологические изменения в нейронах свидетельствуют об их деструкции). Предполагается, что деструктивные изменения в культивируемых нервных клетках, подвергнутых ишемии и реоксигенации, связаны с активацией каспазы-3 (данные получены в совместной работе с лаб. экспериментальной нейроцитологии НИИ мозга РАМН). 

3. Роль нитрергической системы в эффектах ранней социальной депривации

В мозге цыплят, подвергнутых социальному стрессу, активность NO-синтазы изменяется в зависимости от типа стресса и исследованной макроструктуры. Активность NO-синтазы возрастала при острой сепарации (в мозжечке) и хронической сепарации (вщ всех исследованных структурах). Хроническая изоляция не оказывала существенного влияния на активность фермента. 

Ранняя социальная депривация Octodon degus вызывает количественные изменения нейронов, содержащих NADPH-диафоразу в префрональной коре и n. accumbens. Выявлены изменения нейронов, содержащих НАДФН-диафоразу, в мозге 45-дневных Octodon degus после периодической сепарации сосунков от матери и ранней (сразу после прекращения сосания) социальной изоляции Сепарация вызывала снижение числа нейронов, содержащих НАДФН-диафоразу, в corpus callosum.Социальная изоляция снижала плотность НАДФН-диафораза – содержащих нейронов в corpus callosum, а также в прецентральном медиальном кортексе (только у самок). Полученные резуьтаты могут быть объяснены избыточной редукцией нейронов, содержащих НАДФН-диафоразу, или ингибированием активности этого фермента в результате ранней социальной изоляции/сепарацииe и указывают на связь раннего отрицательного социо-эмоционального опыта и созревания нейронов, содержащих НАДФН-диафоразу. У Octodon degu активность фермента повышена в коре больших полушарий непосредственно после 24-дневной изоляции (начиная с 21-дневного возраста). Повторяемая сепарация сосунков Octodon degu от матерей (до 21-го дня) не оказывала достоверного влияния на активность NO-синтазы в коре больших полушарий 45-дневных животных (данные получены в совместной работе с группой ювенильного обучения Института Нейробиологии, Магдебург, ФРГ). 

Ранний социальный стресс у крыс Wistar вызывает увеличение активности NO-синтазы в мозге. 6-недельная изоляция крысят-самцов начиная с возраста 21 день, приводит к увеличению активности NO-синтазы в гиппокампе крыс сразу после социального стресса и в гиппокампе и коре больших полушарий через 10 недель после возвращения животных в нормальное окружение из изоляции. 

Таким образом, ранний социальный изоляционный стресс у крыс Wistar и американских кустарниковых крыс Octodon degu вызывает повышение активности NO-синтазы в специфических отделах мозга. Этот феномен, выявляемый как непосредственно после социального стресса, так и в отдаленный период, по-видимому, опосредует длительные нарушения поведения, наблюдаемые у этих животных. 

4. Моделирование болезни Альцгеймера на крысах

Проведено исследование возможной связи между амнезией, вызванной центральным введением β-амилоида (25-35) [Аβ(25-35)] и нейродегенеративными изменениями в гиппокампе. Самцам крыс линии Вистар однократно интрацеребровентрикулярно вводили Аβ(25-35) в дозе 15 нмоль. Через 1 месяц после введения животных обучали в восьмирукавном радиальном лабиринте. По окончании обучения было проведено гистологическое исследование состояния гиппокампа на срезах мозга, окрашенных гематоксилином/эозином. Аβ(25-35) вызывал нарушение долговременной (референтной) и рабочей памяти при обучении в лабиринте. Выявлено умеренное снижение числа нейронов в поле СА1 гиппокампа; число клеток в поле СА3 не изменялось. Установлено, что число ошибок, допущенных животными при обучении в лабиринте, отрицательно коррелировало с числом нервных клеток в поле СА1 гиппокампа. Таким образом, впервые продемонстрировано, что нарушения обучения и памяти, вызванные однократным введением Аβ(25-35) специфически связаны с нейродегенерацией в поле СА1 гиппокампа у крыс. 

Исследовано также влияние интрацеребровентрикулярного введенияАβ(25-35) на воспроизведение предварительно усвоенного навыка поиска пищи в 8-рукавном радиальном лабиринте у крыс. Аβ(25-35) вводили билатерально в дозе 15 и 30 нмоль/животное через 7 дней после предварительного обучения. Тестирование проводили через 60 дней после введения пептида. Показано, что Аβ(25-35) нарушает кратковременную рабочую память у крыс, не оказывая существенного влияния на сохранность навыка. Не удалось выявить зависимости нарушения памяти от дозы пептида. Представленные данные свидетельствуют о способности Аβ(25-35) в большей степени ухудшать функцию рабочей памяти, чем долговременной памяти. 

Интрагиппокампальное введение нейротоксичного фрагмента бета-амилоида 25-35 в дозе 3 нмоль вызывает нейродегенерацию, сопровождающуюся появлением апоптотических ядер, активацией астроглии и каспазы-3. Фактор некроза опухоли альфа, введенный интрацеребровентрикулярно в дозе 0.5 мкг, не вызывает нейродегенерации, активации астроглии и каспазы-3, однако усиливает нейродегенерацию и активацию астроглии, вызванные фрагментом бета-амилоида, без дополнительного усиления апоптоза и активации каспазы в гиппокампе. Предполагается, что усиление фактором некроза опухоли альфа нейродегенерацивных процессов, вызванных бета-амилоидным фрагментом 25-35, не связано с активацией апоптоза. 

Получены предварительные результаты об эффектах фактора некроза опухоли альфа на поведение крыс. Этот цитокин не нарушает обучение крыс в 8-рукавном радиальном лабиринте, однако оказывает значимое действие на поведение в тесте пассивного избегания. 

5. Исследование молекулярных механизмов нейродегенерации при моделировании судорожной активности

Введение мышам пентилентеразола в дозе 85 мг/кг подкожно вызывает ингибирование активности каспазы-3 в отделах мозга животных. Этот эффект пентилентетразола может быть связан с развитием окислительного стресса в ткани мозга, поскольку, как было показано нами ранее, моделирование окислительного стресса in vitro добавлением пероксида водорода дозо-зависимо ингибирует активность каспазы-3 в нейроноподобных клетках РС12. 

Судорожная готовность, вызванная хроническим введением подпороговых доз конвульсанта (пентилентетразоловый киндлинг), сопровождается изменениями пластичности мозга, выражающимися в функциональных (нарушение обучения) и структурных (нейродегенерация в специфических областях гиппокампа) перестройках. Изменения нейропластичности опосредованы развитием окислительного стресса и активацией каспазы-3 в гиппокампе. 

Судорожная готовность, вызванная хроническим введением подпороговых доз конвульсанта пентилентетразола (пентилентетразоловый киндлинг), сопровождается изменениями пластичности мозга, выражающимися в функциональных (нарушение обучения) и структурных (нейродегенерация в специфических областях гиппокампа) перестройках. Предполагается, что изменения нейропластичности опосредованы развитием окислительного стресса и активацией каспазы-3 в гиппокампе. При пентилентетразоловом киндлинге обнаружены корреляционные зависимости между степенью нейродегенерации в полях гиппокампа СА1 и СА3, а также в зубчатой фасции и выраженностью судорожной активности. Нарушения выработки реакции активного избегания также коррелировали с выраженностью судорожной активности, и нейродегенерацией в поле СА3 гиппокампа. Таким образом, на модели пентилентетразолового киндлинга впервые получены количественные данные для экспериментального подтверждения связи между судорожной активностью, нейродегенерацией в гиппокампе и способностью животных к обучению. 

Исследовано соотношение между судорожной активностью, вызванной повторяющимся электрошоком (ЭШ), и структурными изменениями в гиппокампе мышей Balb/С. Через 2 и 7 дней после завершения ЭШ мозг животных фиксировали и срезы окрашивали по Нисслю и иммуногистохимически на апоптотические ядра (TUNEL). Дополнительно в отделах мозга измеряли активность ключевого фермента апоптоза каспазы-3 сразу после завершения ЭШ. Числа нейронов достоверно снижалось в поле СА1 и зубчатой фасции, но не в поле СА3 гиппокампа. Число клеток в СА1 и СА3 обратно коррелировало с интенсивностью судорог. Признаков апоптотической гибели нейронов выявлено не было, а активность каспазы-3 была достоверно снижена в гиппокампе после ЭШ. Представленные данные подтверждают представление о функциональных изменениях нейронов после ЭШ и углубляют это представление, непосредственно свидетельствуя об умеренной (в пределах 10%), но достоверной гибели нейронов в определенных областях гиппокампа. Обратные корреляции числа клеток со степенью судорожной активности позволяют предположить, что основной причиной гибели нейронов являются судороги, вызванные ЭШ. 

6. Моделирование инсульта и оценку неврологического статуса животных

Предложен новый метод оценки функционального состояния крыс после ишемии мозга по способности животного вытягивать язык. Результаты, получаемые при помощи данного метода на модели фокальной ишемии, вызванной окклюзией среднемозговой артерии, достоверно коррелируют с данными других тестов на неврологический дефицит и размером инфаркта мозга. Метод чрезвычайно прост и может быть использован как компонент в батарее тестов при оценке постишемических функциональных нарушений или самостоятельно при скрининге нейропротекторных препаратов и воздействий. 

7. Разработка и подтверждение гипотезы о роли каспазы-3 в механизмах нейропластичности, не связанных с гибелью нервных клеток

В условиях вызванного фактором некроза опухоли альфа апоптоза или вызванной форбол-12-миристат-13-ацетатом дифференциации в культивируемых клетках U-937 обнаружена сходная активация Ca2+/Mg2+-зависимой нуклеазы, сопровождающаяся активацией каспазы-3 и появлением нуклеосомальных фрагментов ДНК. Полученные данные свидетельствуют о том, что фрагментация хроматина в апоптотических и дифференцирующихся клетках осуществляется одними и теми же ферментами апоптотического каскада (данные получены в совместной работе с лабораторией клеточной инженерии института теоретической и экспериментальной биофизики РАН). 

На культурах нейроноподобных клеток РС12 показано, что апоптоз, вызванный перекисью водорода, не сопровождается активацией каспазы-3 или каспазы-1. В экспериментах in vitro показано, что активность каспазы-3 в клетках РС12 дозо-зависимо снижается в присутствии перекиси водорода. 

Установлено, что активность каспазы-3 в мозге сусликов закономерно изменяется в течение гибернационного цикла. В большинстве исследованных отделов мозга максимальная активность наблюдается в период гибернации или при вхождении в спячку. Поскольку не описано апоптотической гибели нейронов в мозге сусликов в период гибернации, предполагается, что каспаза выполняет не-апоптотическую функцию, связанную с пластическими перестройками клеток мозга при гибернации. 

Показано, что ингибирование каспазы-3, ключевого фермента апоптотической гибели нейронов, блокирует развитие NMDA-зависимой длительной потенциации в срезах гиппокампа крысы и длительного увеличения ВПСП в идентифицированных командных нейронах улитки при тетанизации на фоне серотонина, а также нарушает обучение крыс реакции активного избегания. Полученные результаты позволяют постулировать новый механизм реализации феноменов нейропластичности, общий для позвоночных и беспозвоночных, включающий ограниченный протеолиз специфических субстратов, и свидетельствуют о плейотропной роли каспазы-3 в нервной системе. (представлено ла бораториями функциональной биохимии нервной системы, нейроонтогенеза, клеточной нейробиологии обучения). 

На основании полученных результатов сформулирована гипотеза о роли каспазы-3 в механизмах нейропластичности, не связанных с гибелью нервных клеток. 

Научно-экспериментальная база . Основные методы

Лаборатория расположена по адресу Ленинский пр., 33, кор. 1. Имеются помещения для экспериментальных исследований, изотопный блок и виварий. 

Лаборатория имеет: 

1. оборудование для исследований поведения (установки для изучения активного и пассивного избегания, 8-рукавный и У-образный лабиринты),
2. установки для создания стрессорных ситуаций,
3. установка для моделирования судорожной активности максимальным электрошоком,
4. оборудованные рабочие места для моделирования инсульта у мышей и крыс (окклюзия четырех артерий и окклюзия среднемозговой артерии),
5. стереотаксические установки для реализации инъекционных моделей нейродегенеоации,
6. оборудования для патоморфологических и иммуногистохимических экспериментов,
7. оборудование для проведения биохимических исследований (оптические приборы, центрифуги, оборудованный изотопный блок) позволяет при наличии соответствующих реактивов проводить широкий спектр биохимических исследований,
8. оборудование для Вестерн-блоттинга
9. оборудование для исследования связывания рецепторов с лигандами.

На имеющемся оборудовании проводятся комплексные исследования поведения и нейрохимических механизмов обучения и памяти в норме и при патологиях, в частности, при моделировании нейродегенерации различного геенна.

Монографии

1. Gulyaeva NV, Stepanichev MYu. Biochemical correlates of individual behavior. In: Complex Brain Functions: Conceptual Advances in Russian Neuroscience. Eds. Miller R, Ivanitsky AM, Balaban PM. Australia et al., Harwood Academic Publ., 1999. P. 301-316.

Список сотрудников

Список публикаций